La relación de Peter Parker (Tobey Maguire) y Mary Jane (Kirsten Dunst) va viento en popa. Harry (James Franco) ha sufrido un accidente y pierde temporalmente la memoria, olvidando su rencor contra Peter. El fugitivo Flint Marko (Thomas Haden Church), huyendo de la policía, cae en una máquina aceleradora de partículas, fusionándose su cuerpo con arena y convirtiéndose en Sand-Man. Un fotógrafo arrogante y deshonesto, Eddie Brock (Topher Grace), le quita a Peter su puesto en el Daily Bugle mostrando fotos falsas de Spider-Man como un criminal. Flint Marko es sindicado como el verdadero asesino de Ben Parker, tío de Peter. Un simbionte extraterrestre toma a Peter como huésped y lo transforma en el Hombre Araña negro, dominado por la ira, el deseo de venganza y la soberbia. El cambio en la personalidad de Peter resquebraja su relación con Mary Jane. Peter se deshace del simbionte, que termina apoderándose del cuerpo de Eddie Brock y dando vida a Venon. Sand-Man y Venom se unen para acabar con Spider-Man. Peter tiene todas las de perder; pero contará con la ayuda de un antiguo rival.